核酸是生物信息大分子，天然存在的核酸可以分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）两大类。核酸在酶的作用下水解为核苷酸，作为核酸的基本组成单位，核苷酸则由碱基、戊糖和磷酸3种成分连接而成。DNA的基本组成单位是脱氧核糖核苷酸，RNA的基本组成单位是核糖核苷酸。   碱基属于生物碱，是构成核苷酸的基本组分之一。构成核苷酸的5种碱基分别属于嘌呤和嘧啶两类含氮杂环化合物（图1）。腺嘌呤 （adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）、胞嘧啶（cytosine，C）既是DNA的组成碱基，也是RNA的组成碱基；而胸腺嘧啶（thymine，T）仅存在于DNA分子中，尿嘧啶（uracil ，U）仅存在于RNA分子中。   图1. 核苷酸，碱基结构示意图   图片来源Antiviral Nucleoside and Nucleotide Analogs: A Review   体外转录生成mRNA具有巨大的应用潜力。采用纳米脂质颗粒（LNP）递送方式的mRNA进入细胞是经过内吞摄取的过程跨越细胞膜。而机体内很多免疫和非免疫细胞都有专门的RNA受体，当外源RNA进入机体后，如果与RNA受体发生结合，就会激发免疫反应。在非免疫细胞细胞质中存在一种称为视黄酸诱导基因I（RIG-I）的受体，在识别RNA后，会诱导固有免疫反应。此外，巨噬细胞和树突状细胞中具有Toll样受体（TLRs）,在与RNA结合，触发信号级联反应，导致炎症、翻译抑制和RNA降解。富含GU的序列尤其容易被TLR识别。   幸运的是，已有研究表明[1]，采用特定化学修饰核苷酸合成的 mRNA可以减少与先天免疫受体的相互作用，降低了mRNA的自身免疫原性同时大大提高了疗效。多种修饰核苷都可以减少TLR激活，包括假尿苷（ψ）、N1-甲基假尿苷 （m1ψ），5-甲氧基尿苷（5moU），5-甲基尿苷 （m5U），2-硫尿苷（s2U），5-甲基胞苷（m5C）， N1-甲基腺苷（m1A）和N6-甲基腺苷 （m6A）。在哺乳动物细胞内转录后会自然发生碱基修饰，所以采用修饰碱基替换天然碱基合成的mRNA在机体内不会有翻译抑制现象。在哺乳动物mRNA中三分之一的腺苷酸是m6A修饰核苷酸。m6A碱基是真核生物中最常见的修饰碱基。在转染树突状细胞后，m6A和s2U修饰核苷酸可以减少TLR3活化，m5C、m5U、s2U、m6A和ψ修饰核苷酸降低TLR7和TLR8活化。其中，m5C和ψ最为常用，它们最高将细胞内翻译量提高了9倍。经体内实验证实，在含假尿苷的mRNA注入小鼠体内后，可以观察到较低的免疫原性和较高的翻译水平。最近的一项研究发现[4]，m1ψ是一种有效的修饰碱基。与ψ或m5C/ψ相比，m1ψ修饰的mRNA表达增加了13倍。   具体的核苷酸替换方式有：用N1-甲基腺苷（m1A）、N6-甲基腺苷（m6A）替代天然腺苷，用5-甲基胞苷（m5C）替代天然胞苷，用5-甲基尿苷（m5U）、s2U、5-甲氧基尿苷（5moU）、假尿苷（ψ）、N1-甲基假尿苷m1ψ）替代天然尿苷。   图2. 天然核苷与对应修饰核苷结构示意图[1]   固有免疫系统能够识别未修饰mRNA，修饰mRNA能够抑制RNA的免疫刺激效应。如图3 显示未修饰mRNA转染单核细胞来源的树突状细胞后，细胞分泌大量TNFα和IL-12p70。而m5C、m5C/ψ、m6A、ψ或s2U修饰的mRNA转入细胞后，细胞因子产生量明显减少。在原代树突状细胞中，m6A和m5C修饰的mRNA与未修饰的mRNA一样会诱导产生细胞因子，只有尿苷修饰mRNA没有诱导产生TNFα和IFNα。   图3.  mRNA转染的DC细胞分泌细胞因子[2]   Katalin Karikó等人用假尿苷修饰的mRNAs在体外转染树突状细胞，与未修饰mRNAs相比，实现了更高水平的翻译。作者在小鼠体内评价编码促红细胞生成素（EPO）的mRNA。   图4.  小鼠腹腔注射EPO mRNA后生理反应[3]   图4a显示一次性注射100ng假尿苷修饰mRNA后6小时内小鼠血清的EPO水平显著升高，并且能够维持4天。相比之下，含有尿苷的mRNA产生的EPO水平低10-100倍，仅持续1天。图4b显示假尿苷修饰mRNA翻译的EPO提高了网织红细胞和血细胞的比例。仅仅10ng 含假尿苷mRNA就能使网织红细胞数量翻倍。每周注射100ng EPO mRNA足以将红细胞细胞压积从43%增加到57%。图4e显示即使大量注射含假尿苷mRNA，血浆中炎性细胞因子与阴性对照相比也没有明显增多。进一步研究发现，在猕猴腹腔内注射假尿苷修饰EPO mRNA后血清EPO水平同样显著增加，猕猴没有出现明显不良反应，IFN-α、TNF-α、和IL-6水平也没有上升。表明假尿苷在降低外源mRNA的自身免疫原性同时，提高了其翻译效率。   假尿苷修饰mRNA后具有优越的翻译特性。加强翻译的机制有：(i)减少PKR激活；(ii)抵抗RNaseL介导的酶切，从而增加mRNA稳定性；(iii)减少2'-5'寡聚腺苷酸合成酶激活和核糖体RNA切割。假尿苷与其他修饰核苷酸一样可以减少RNA诱导固有免疫。     图5.  修饰(Ψ, m1Ψ, m5C/Ψ, m5C/m1Ψ)和未修饰的编码荧光素酶的mRNA转染A549细胞后蛋白表达与细胞因子分泌[4]   Oliwia Andries 等人用m5C/m1Ψ修饰mRNA，其蛋白翻译产量是m5C/Ψ修饰mRNA的44倍，优于当前技术水平的假尿苷（ψ）和m5C/ψ修饰的mRNA平台。作者发现（m5C/）m1ψ修饰的mRNA与m5C/ψ修饰的mRNA相比，可以减少固有免疫的产生并提高细胞存活率。m5C/m1ψ修饰的mRNA避免激活内吞小体Toll样受体3（TLR3）。图5A显示编码荧光素酶mRNA转染A549细胞3小时后翻译产量最大。其中m5C/m1Ψ修饰的mRNA产量是未修饰mRNA的916.7倍，是Ψ修饰的mRNA的118倍，是m1Ψ修饰的mRNA的23倍，是m5C/Ψ修饰的mRNA的44倍。图5B显示转染了Ψ、m1Ψ、m5C/Ψ和m5C/m1Ψ修饰的mRNA的A549细胞诱导产生的IFN-β分别比未修饰的mRNA少3、11、4和14倍。   之后Oliwia Andries 等人在小鼠体内进一步研究修饰mRNA翻译。与之前结果一样，修饰后mRNA翻译产量要明显优于未修饰mRNA。令人意外的是，单修饰mRNA(Ψ和m1Ψ)体内翻译产量要明显优于对应的双修饰mRNA(m5C/Ψ and m5C/m1Ψ)。而且m5C/Ψ修饰mRNA与未修饰mRNA相比表现出更低的荧光素酶活性。最重要的是m1Ψ修饰的mRNA翻译产量要优于所有其他修饰组合，是Ψ修饰mRNA的13倍。证实了m1Ψ修饰的mRNA具备更优异的翻译效率。   已上市的两款新冠mRNA疫苗均使用了修饰核苷酸替代天然核苷酸，修饰核苷酸正在发挥它的巨大应用潜力。   近岸蛋白提供GMP级核苷酸和修饰核苷酸：   核苷酸产品：   目录号 产品名称 浓度 结构 GMP-S023A/ GMP-S023N ATP, GMP Grade 100mM/10mM GMP-S024A/ GMP-S024N GTP, GMP Grade   100mM/10mM GMP-S025A CTP, GMP Grade 100mM   GMP-S026A UTP, GMP Grade 100mM     修饰核苷产品：   目录号 产品名称 浓度 结构 GMP-S042 N1-Me-Pseudo UTP,  GMP Grade 100mM GMP-S048 Pseudo UTP, GMP Grade 100mM   mRNA相关产品：   目录号 产品名称 GMP-E121 T7 RNA Polymerase, GMP Grade GMP-EB121 10×Transcription Buffer, GMP Grade GMP-M062 Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade GMP-M072 mRNA Cap 2´-O-Methyltransferase, GMP Grade GMP-EB62 10×Capping Reaction Buffer, GMP Grade GMP-S062 SAM (32mM), GMP Grade GMP-S162 GTP(10mM), GMP Grade GMP-M012 E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade GMP-EB12 10×Poly(A) Polymerase Buffer, GMP Grade GMP-M036 Pyrophosphatase, Inorganic （yeast）, GMP Grade GMP-E125 RNase Inhibitor, GMP Grade GMP-E127 DNase I, GMP Grade GMP-RE026 BsaI, GMP Grade GMP-EB026 10×BsaI Reaction Buffer , GMP Grade GMP-E131 T7 RNA Transcription Enzyme Mix, GMP Grade GMP-EB131 10×Transcription Buffer, GMP Grade MR008 eGFP mRNA MR009 Luciferase mRNA E131 T7 High Yield RNA Transcription kit E135 Thermostable T7 RNA Polymerase M082 Cap 1 Capping System N243 RNA Clean Beads S125 Lithium Chloride Precipitation Solution   引用文献:   1. Hajj, K., Whitehead, K. Tools for translation: non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nat Rev Mater 2, 17056 （2017）. https://doi.org/10.1038/natrevmats.2017.56   2. Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA.   3. Katalin Karikó, Hiromi Muramatsu, Jason M Keller, Drew Weissman,Increased Erythropoiesis in Mice Injected With Submicrogram Quantities of Pseudouridine-containing mRNA Encoding Erythropoietin,Molecular Therapy,Volume 20, Issue 5,2012,Pages 948-953,   4. Oliwia Andries, Séan Mc Cafferty, Stefaan C. De Smedt, Ron Weiss, Niek N. Sanders, Tasuku Kitada, N1-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice,Journal of Controlled Release,Volume 217,2015,Pages 337-344.   苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，是一家专注于重组蛋白应用解决方案的高新技术企业，主营业务为靶点及细胞因子类蛋白、重组抗体、酶及试剂的研发、生产和销售，并提供相关技术服务。公司定位为医疗健康与生命科学领域原料与技术解决方案的上游供应商，致力于为下游客户提供及时、稳定、优质的产品及服务，助力全球生物医药企业和研究机构的技术与产品创新升级。 详询www.novoprotein.com.cn或致电400-600-0940。